ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки.
Таким образом, даже если среди миллионов клеток человеческого организма затеряется не сам живой вирус, а лишь частица его ДНК, то ПЦР, если ей ничто не помешает, пожалуй, справится с задачей и сообщит о пребывании «чужака» положительным результатом. В этом суть ПЦР и ее основное достоинство.
К лаборатории, осуществляющей ПЦР-диагностику, предъявляются высочайшие требования в плане оборудования, тест-систем и квалификации медицинского персонала. Это высокотехнологичная лаборатория, располагающая арсеналом высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов, поэтому особых недостатков она не имеет. Разве что выдает положительный результат при отсутствии клинических проявлений и тем самым ставит лечебника перед дилеммой: стоит начинать лечение или нет?
Врач, наблюдающий пациента, начинает сомневаться в достоверности результатов тестирования, поскольку никаких признаков заболевания не видит. Но все же, учитывая высокую чувствительность ПЦР-системы, следует помнить, что она обнаруживает возбудителя даже в доклинической стадии , а положительный результат в таком случае является скорее достоинством, чем недостатком. Исходя из этого, лечащий врач должен сам принять решение о целесообразности терапии, взяв во внимание и другие аргументы «за» и «против».
Преимущества диагностики с помощью полимеразной цепной реакции очевидны:
Кроме этого, во избежание недоразумений, иной раз возникающих при диагностике, ПЦР защищает себя еще и тем, что ее результаты могут зафиксироваться (фотография, компьютер) с целью использования их в экспертных целях, если будет на то необходимость.
Нормой в ответах ПЦР считают отрицательный результат , указывающий на отсутствие фрагментов чужеродных нуклеиновых кислот, положительный ответ будет свидетельствовать о наличии инфекции в организме, цифровые значения означают состояние вируса и его концентрацию на момент тестирования. Однако полную расшифровку анализа осуществляет врач, прошедший специальную учебу по теме «ПЦР». Пытаться же интерпретировать результаты самостоятельно не имеет никакого смысла, поскольку можно, что скорее всего и произойдет, неправильно понять и начать заранее волноваться.
Как в любых других исследованиях, иной раз результаты теста оказываются ложноположительными или ложноотрицательными , где ПЦР исключением не является. Подобное может происходить в случаях:
Это говорит о том, что к ПЦР – диагностике инфекций нужно подходить внимательно, осторожно и аккуратно, иначе образцы материала могут поменять свое структурное строение или вовсе разрушиться.
Этапы ПЦР-диагностики. Ложные результаты могут дать нарушения на любом из этапов исследования
ПЦР-диагностика инфекций относится к категории «золотых стандартов» среди других лабораторных методов, поэтому ее можно применить для поиска возбудителей многих заболеваний, на первый взгляд не имеющих ничего общего между собой:
ПЦР-диагностика инфекций, передающихся половым путем, имеет особую значимость, поскольку заболевания, вызванные таким образом, часто длительное время протекают без каких бы то ни было клинических проявлений, зато при беременности начинают активизироваться и, таким образом, угрожать здоровью и даже жизни ребенка. Аналогично себя ведут и . Некоторые из них («торч») относятся одновременно и к ИППП, поэтому последние требуют более подробного рассмотрения. Ознакомиться с самыми популярными методиками читатель сможет в следующих разделах статьи.
Сразу заметим, что подготовка к ПЦР довольно простая, никаких особых усилий со стороны пациента не требующая. Нужно лишь выполнить три несложных задания:
Метод ПЦР не отличается «кровожадностью», поэтому приемлет любую биологическую среду, содержащую предполагаемый инфекционный агент.Обычно выбор – что нужно взять для исследования, остается за врачом.
Таким образом, в поисках возбудителя, кроме анализа крови (хотя он тоже подходит и в большинстве случаях берется параллельно другому материалу), можно использовать:
К вышеперечисленному хочется добавить, что материала для тестирования во всех случаях, даже в соскобах и выделениях, будет достаточно, так как тестирование методом ПЦР больших объемов не требует, анализу хватает и нескольких микролитров, которые обычно берут в микропробирку типа «эппендорф» и отправляют на исследование.
Обычно при прохождении анонимного обследования в случае положительных результатов иммуноблотинга, диагностику повторяют заново. Если диагноз подтверждается, пациенту назначают дополнительные исследования:
Методом ПЦР можно выявлять возбудителей , чаще всего тест используется для диагностики С гепатита, который плохо определяется другими методами.
Вирус гепатита С (РНК-содержащий) по своему поведению в организме человека напоминает ВИЧ. Вклиниваясь в геном клеток печени (гепатоцитов), он пребывает там в ожидании своего часа, который может наступить хоть через 2 года, хоть через 20 лет, поэтому медики прозвали его «ласковым убийцей». Гепатит С приводит к формированию злокачественного процесса в печеночной паренхиме, который проявляется на поздних стадиях. Все эти события иммунная система не замечает, принимая вирус за гепатоцит. Правда, антитела к вирусу в некоторых количествах вырабатываются, однако они не обеспечивают достойный иммунный ответ. Для диагностики ИФА на гепатит С не очень информативен, поскольку указывает на то, что вирус оставил следы, а ушел ли сам – неизвестно. При ВГС известны случаи самоизлечения, в то время как антитела против вируса остаются и продолжают циркулировать пожизненно (иммунологическая память). ПЦР заметно опережает образование антител и может выявить вирусную частицу уже через 1-1,5 недели, в то время как АТ могут появиться в интервале от 2 месяцев до полугода
ПЦР-диагностика в случае подозрения на разгул вируса гепатита С в организме человека является наиболее оптимальным методом исследования, ибо только она способна распознать присутствие «ласкового врага» в крови или биоптате печени пациента.
Однако иной раз имеют место случаи, когда АТ положительны, а результат ПЦР – отрицательный. Такое иногда происходит при очень низком количестве вируса или при его «дремлющем» состоянии в печени без выхода в кровяное русло. Чтобы все-таки найти истину, у пациента берут повторный анализ, а то и не один.
Если не произойдет самоизлечение, тоже может, ничем себя не проявляя, долго персистировать в организме хозяина, который об этом даже не подозревает, поскольку ПЦР сделать не доводилось, а симптомы болезни отсутствовали. Однако наличие папилломовирусной инфекции, пусть и латентной, далеко не безразлично для здоровья человека, где особую опасность несут определенные типы вируса, вызывающие онкологические заболевания (типы 16, 18).
Чаще от ВПЧ страдает женская половина населения, так как вирус больше любит женскую половую сферу, а особенно – шейку матки, где некоторые типы вирусов способствуют развитию диспластических процессов, а затем и рака шейки матки, если не лечить дисплазию и дать волю вирусу. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.
Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения или гонококка, если есть более доступные и дешевые?
TORCH-инфекции и ИППП настолько взаимосвязаны, что, порой, трудно определить, к какой группе следует отнести тот или иной возбудитель. В них вообще бывает сложно разобраться, так как это довольно разнообразные группы микроорганизмов, которые могут передаваться половым путем всегда или только при определенных условиях (иммунодефицит), а могут представлять интерес лишь при беременности, ввиду возможного негативного влияния на ее течение и на плод.
В основе развития клинических проявлений лежат разные возбудители, найти которые бывает под силу только ПЦР, что и является ее основной задачей иногда совместно с ИФА, а иногда в качестве единственного подтверждающего теста, особенно, если симптоматика заболевания отсутствует. Такую непростую ситуацию может создавать полимикробная инфекция, которая, помимо явных возбудителей, включает еще и условно-патогенные.
Уреаплазма зачастую рассматривается в паре с микоплазмой. И это неспроста. Данные виды, как и хламидию, не относят ни к вирусам, ни к бактериям, они проживают внутри клеток и относятся к ИППП, хотя их присутствие в здоровом организме тоже далеко не редкость. Так вот, чтобы отличить здорового носителя от больного человека, нужны особые методы, где ПЦР считается наиболее надежным, поскольку, ввиду особенностей строения и поведения этих микроорганизмов, другие исследования оказываются неэффективными.
Что касается (тип 1, 2) и , который тоже относится к герпесвирусам (тип 5), то здесь тоже ситуация неоднозначная. Инфицированность населения земного шара приближается к 100%, поэтому в данном случае очень важна идентификация вируса и его доза, что особенно играет роль при беременности, ведь взрослому человеку, вирус, прижившийся в его организме, часто не доставляет никаких хлопот и признаков заболевания не дает.
Поэтому не следует игнорировать назначенное врачом подобное обследование, ведь в некоторых случаях полимеразная цепная реакция является обязательным и необходимым методом лабораторной диагностики, способным защитить от серьезных осложнений не только женщину, но и маленького, еще не родившегося, человечка.
В заключение хочется отметить, что такой замечательный метод, как ПЦР, вот уже более 30 лет служит человечеству. При этом, задачи теста не ограничиваются поиском возбудителей инфекционных заболеваний. Полимеразная цепная реакция, рожденная на почве молекулярной биологии, неразрывно связана с генетикой, она успешно применяется в криминалистике для идентификации личности , в судебной медицине для установления отцовства, в ветеринарии, если клиника для животных имеет возможности приобретать дорогое оборудование, а также в других сферах (промышленность, сельское хозяйство и пр.).
Федеральное агентство по образованию
Государственное образовательное учреждение
Высшего профессионального образования
"Карельская государственная педагогическая академия"
Курсовая работа на тему:
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение
Выполнила: студентка Корягина Валерия Александровна
Проверила: Карпикова Наталья Михайловна
Петрозаводск 2013
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.5.4 Эффект "Плато"
1.5.6 Амплификация
Заключение
Введение
Последнее двадцатилетие ознаменовалось широким внедрением в биологические, медицинские и сельскохозяйственные науки молекулярно-генетических методов.
К началу 70-х годов казалось, что молекулярная биология достигла определенной степени завершенности. В этот период главным объектом молекулярно-генетических исследований были микроорганизмы. Переход к эукариотам поставил перед исследователями совершенно новые проблемы, которые не могли быть решены с использованием существовавших в то время методов генетического анализа. Прорыв в развитии молекулярной генетики стал возможен благодаря появлению нового экспериментального инструмента - рестрикационных эндонуклеаз. В последующие годы количество методов непосредственного анализа ДНК, основанных на качественно различающихся подходах, начало стремительно увеличиваться.
Современные технологии во многих случаях позволили на более глубоком уровне начать изучение тонкой структурно-функциональной организации ядерных и внеядерных геномов различных организмов. Особое значение это имело для разработки новых методов диагностики и лечения различных заболеваний. Не менее важным оказалась возможность использования достижения молекулярной генетики в популяционной биологии и в селекции для выявления и анализа генетической изменчивости популяций, сортов и штаммов, идентификации и паспортизации хозяйственно ценных особей, создания генетически модифицированных организмов и для решения других вопросов.
Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Нет универсального метода, который мог бы позволить решить все возникающие проблемы. Поэтому выбор конкретного метода для проводимого исследования является одним из важнейших этапов любой научной работы.
Глава 1. Литературный обзор
1.1 История открытия Полимеразной цепной реакции (ПЦР)
В 1983 г. К.Б. Мюллис и др. опубликовали и запатентовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), которому суждено было оказать глубочайшее влияние на все области исследования и прикладного использования нуклеиновых кислот. Значение этого метода для молекулярной биологии и генетики оказалось столь велико и очевидно, что уже через семь лет автору была присуждена Нобелевская премия по химии.
В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq -полимеразой.
Возможность амплификации любого сегмента ДНК, последовательность нуклеотидов которого известна, и получение его по завершении ПЦР в гомогенном виде и препаративном количестве делают ПЦР альтернативным методом молекулярного клонирования коротких фрагментов ДНК. При этом не возникает необходимости в применении сложных методических приемов, которые используют в генной инженерии при обычном клонировании. Разработка метода ПЦР во многом расширила методические возможности молекулярной генетики, и, в частности, генной инженерии, причем настолько, что это кардинально изменило и усилило научный потенциал многих её направлений.
1.2 Разновидности полимеразной цепной реакции (ПЦР)
·Вложенная ПЦР - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
·Инвертированная ПЦР - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК - рестриктазами <#"justify">полимеразная цепная реакция праймер
·Групп-специфическая ПЦР - ПЦР для родственных <#"center">1.3 Полимеразная цепная реакция
Открытая в середине 80-х годов, полимеразная цепная реакция (ПЦР) способна увеличить количество копий исходной пробы в миллионы раз в течение нескольких часов. В ходе каждого цикла реакции из исходной молекулы образуются две копии. Каждая из синтезированных копий ДНК может служить матрицей для синтеза новых копий ДНК в следующем цикле. Таким образом, многократное повторение циклов, приводит к возрастанию количества копий в геометрической прогрессии. Из расчетов следует, что даже при наличии 30 циклов, число копий исходной молекулы составит более 1 миллиарда. Даже если учесть, что в ходе каждого цикла дуплицируются не все ампликоны, то общее количество копий, несмотря на это, составляет достаточно большую цифру.
Каждый цикл полимеразной цепной реакции (ПЦР) состоит из следующих этапов:
·Денатурация - Повышение температуры вызывает раскручивание и расщепление двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные;
·Отжиг - Снижение температуры позволяет праймерам присоединиться к комплементарным участкам молекулы ДНК;
·Элонгация - Фермент ДНК-полимераза достраивает комплементарную цепь.
Для амплификации избранного фрагмента используют два олигонуклеотидных праймера (затравки), фланкирующих определенный участок ДНК. Праймеры ориентированы 3-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. ДНК-полимераза осуществляет синтез (достройку) взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с праймеров. При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК. Каждая цепь молекулы ДНК, образующаяся с помощью одного из праймеров, может служить матрицей для синтеза комплементарной цепи ДНК с помощью другого праймера.
1.4 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Полимеразную цепную реакцию проводят в специальных тонкостенных полипропиленовых пробирках, совместимых по размеру с используемым термоциклером (амплификатором) - прибором, который контролирует температурные и временные характеристики этапов полимеразной цепной реакции (ПЦР).
1.5 Принцип метода полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.
Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий:
1.5.1 Наличие в реакционной смеси ряда компонентов
Основными компонентами реакционной (ПЦР) смеси являются: Трис-HCl, KCl, MgCl2, смесь нуклеотидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ), праймеры (олигонуклеотиды), препарат анализируемой ДНК, термостабильная ДНК-полимераза. Каждый из компонентов реакционной смеси непосредственно участвует в полимеразной цепной реакции (ПЦР), а концентрация реагентов напрямую влияет на ход амплификации.
·Трис-HCl - определяет pH реакционной смеси, создает буферную емкость. Активность ДНК-полимеразы зависит от pH среды, поэтому значение водородного показателя напрямую влияет на ход полимеразной цепной реакции. Обычно значение pH находится в пределах 8 - 9,5. Высокое значение pH берется из-за того, что при повышении температуры pH Трил-HCl буфера падает.
·KCl - концентрация хлорида калия до 50 мМ влияет на протекание процессов денатурации и отжига, концентрация свыше 50 мМ ингибирует ДНК-полимеразу.
·MgCl2 - поскольку ДНК-полимераза является Mg2+ - зависимым ферментом, то концентрация ионов магния влияет на активность фермента (Mg2+ образует комплексы с НТФ - именно эти комплексы являются субстратом для полимеразы). Высокая концентрация приводит к увеличению неспецифической амплификации, а низкая ведет - к ингибированию реакции, оптимум (для различных полимераз) находится в области 0,5 - 5мМ. Кроме того, концентрация солей магния влияет на протекание процессов денатурации и отжига - повышение концентрации Mg2+ вызывает повышение температуры плавления ДНК (т.е. температуры, при корой 50% двухцепочечных нитей ДНК разъединяются на одноцепочечные).
·НТФ - нуклеотидтрифосфаты являются непосредственными мономерами нуклеиновых кислот. Для предотвращения цепной терминации рекомендуется равноколличественное соотношение всех четырех нуклеотидтрифосфатов. Низкая концентрация данных компонентов в реакционной смеси увеличивает вероятность ошибки при построении комплементарной цепи ДНК.
·Праймеры - Наиболее оптимальным является использование праймеров с разницей температур плавления не более 2 - 4oС. Иногда при длительном хранении при температуре 4oС, или после большого количества замораживаний - оттаиваний праймеры образуют вторичные структуры - димеры, снижая эффективность протекания ПЦР. Устранение данной проблемы сводится к инкубации на водяной бане (Т=95oС) в течение 3 минут и последующему резкому охлаждению до 0oС.
·Препараты ДНК - количество и качество препарата ДНК (матрицы) непосредственно влияет на ход и параметры полимеразной цепной реакции. Избыточное количество образца ДНК ингибирует полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Примеси различных веществ, находящихся в препарате ДНК, могут также уменьшить эффективность протекания полимеразной цепной реакции (ПЦР): ацетат натрия, хлорид натрия, изопропанол, этанол, гепарин, фенол, мочевина, гемоглобин и др.
·ДНК-полимераза - при использовании малого количества ДНК-полимеразы наблюдается уменьшение синтеза конечного продукта прямо пропорционально размеру фрагментов. Избыток полимеразы в 2 - 4 раза приводит к появлению диффузных спектров, а в 4 - 16 раз - низкомолекулярных неспецифических спектров. Диапазон используемых концентраций - 0,5 - 1,5 единиц активности в перерасчете на 25 мкл ПЦР смеси.
Кроме основных компонентов ПЦР смеси, используют ряд дополнительных веществ, улучшающих качественные и количественные показатели ПЦР: ацетамид (5%) - увеличение растворимости основных компонентов; бетаин (натриевая соль) - стабилизация ДНК-полимеразы, понижение температуры плавления ДНК, выравнивание температуры плавления; альбумин бычий (10-100 мкг/мл) - стабилизация ДНК-полимеразы; диметилсульфоксид (1-10%) - повышение растворимости основных компонентов; формамид (2-10%) - увеличение специфичности отжига; глицерин (15-20%) - увеличение термостабильности фермента, понижение температуры денатурации образца ДНК; сульфат аммония - снижение температуры денатурации и отжига.
1.5.2 Циклический и температурный режим
Общий вид программы полимеразной цепной реакции (ПЦР) следующий:
этап. Длительная первичная денатурация препарата ДНК.1 цикл
этап. Быстрая денатурация препарата ДНК. Отжиг праймеров. Элонгация.30 - 45 циклов.
этап. Длительная элонгация. Охлаждение реакционной смеси.1 цикл.
Каждый элемент этапа - денатурация, отжиг, элонгация - имеет индивидуальные температурные и временные характеристики. Параметры температуры и времени протекания каждого элемента подбирают эмпирически, в соответствии с качественными и количественными показателями продуктов амплификации.
Денатурация. В ходе данного элемента полимеразной цепной реакции происходит расщепление двухцепочечной молекулы ДНК на две одноцепочечные. Температурные параметры денатурации находятся в области 90 - 95oС, но в случае ДНК-образца с большим содержанием гуанина и цитозина, температура должна быть увеличена до 98oС. Температура денатурации должна быть достаточной для полной денатурации - расщепления нитей ДНК и избежания "внезапного охлаждения" или быстрого отжига, однако, термостабильная ДНК-полимераза менее устойчива при высоких температурах. Таким образом, подбор оптимальных температурных параметров денатурации для соотношения праймер/образец (препарат ДНК) является важным условием при проведении амплификации. Если температура денатурации на первом этапе выше 95oС, рекомендуется добавлять ДНК-полимеразу в реакционную смесь после первичной денатурации. Продолжительность данного элемента этапа в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) должна быть достаточной для полной денатурации ДНК, но в то же время не оказывать существенного влияния на активность ДНК-полимеразы при данной температуре.
Отжиг. Температура отжига (Та) - один из важнейших параметров полимеразной цепной реакции. Температура отжига для каждого конкретного праймера подбирается индивидуально. Она зависит от длинны и нуклеотидного состава праймера. Обычно она ниже на 2 - 4oС значения температуры плавления (Тm) праймера. Если температура отжига системы ниже оптимальной, то число неспецифических амплифицированных фрагментов возрастает и, наоборот, более высокая температура уменьшает количество амплифицированных продуктов. При этом концентрация специфических ампликонов может резко снижаться, вплоть до ингибирования полимеразной цепной реакции (ПЦР). Увеличение времени отжига также приводит к увеличению количества неспецифических ампликонов.
Элонгация. Обычно каждый вид термостабильной ДНК-полимеразы имеет индивидуальный температурный оптимум активности. Скорость синтеза ферментом комплементарной нити ДНК также является величиной специфичной для каждой полимеразы (в среднем она составляет 30 - 60 нуклеотидов в секунду, или 1 - 2 тыс. оснований в минуту), поэтому время элонгации подбирается в зависимости от типа ДНК-полимеразы и длинны амплифицируемого региона.
1.5.3 Основные принципы подбора праймеров
При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:
Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3-концам праймеров, т. к именно с них начинает достраивать комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос. Это мешает оценке результатов реакции, т. к легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.
Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.
1.5.4 Эффект "Плато"
Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом "плато".
Термин эффект плато используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации.
В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения эффекта плато влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.
Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на плато". Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.
1.5.5 Подготовка пробы биологического материала
Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.
Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.
Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.
Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.
Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.
1.5.6 Амплификация
Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.
1.6 Состав стандартной реакционной ПЦР смеси
х ПЦР буфер (100 мМ р-р Трис-HCl, pH 9,0, 500 мМ р-р KCl, 25 мМ р-р MgCl2) …….2,5 мкл
Вода (MilliQ) ……………………………………………………….18,8 мкл
Смесь нуклеотидтрифосфатов (дНТФ)
мМ р-р каждого……………………………………….……….0,5 мкл
Праймер 1 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл
Праймер 2 (10 мМ р-р) ………………………………………….….1 мкл
ДНК-полимераза (5 ед. /мкл) ………………………………………0,2 мкл
Образец ДНК (20 нг/мкл) …………………………………………..1 мкл
1.7 Оценка результатов реакции
Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.
Глава 2: Применение Полимеразной цепной реакции
ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.
Криминалистика
ПЦР используют для сравнения так называемых "генетических отпечатков пальцев". Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т.п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев.
Установление отцовства
Результаты электрофореза ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью ПЦР. Отец. Ребенок. Мать. Ребенок унаследовал некоторые особенности генетического отпечатка обоих родителей, что дало новый, уникальный отпечаток.
Хотя "генетические отпечатки пальцев" уникальны, родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.
Медицинская диагностика
ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.
Персонализированная медицина
Иногда лекарства оказываются токсичными или аллергенными для некоторых пациентов. Причины этого - отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром может быть более активен, у другого - менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием.
Клонирование генов
Клонирование генов - это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.
Секвенирование ДНК
В методе секвенирования с использованием меченых флуоресцентной меткой или радиоактивным изотопом дидезоксинуклеотидов ПЦР является неотъемлемой частью, так как именно в ходе полимеризации в цепь ДНК встраиваются производные нуклеотидов, меченые флуоресцентной или радиоактивной меткой. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле.
Мутагенез
В настоящее время ПЦР стала основным методом проведения мутагенеза. Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой.
Метод ПЦР позволил проанализировать наличие последовательностей вирусов папилломы человека в срезах биопсий новообразований шейки матки человека, залитых парафином за 40 лет до данного исследования. Более того, с помощью ПЦР удалось амплифицировать, и клонировать фрагменты митохондриальной ДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет!
На лизатах индивидуальных сперматозоидов человека продемонстрирована возможность одновременно анализировать два локуса, расположенных на разных негомологичных хромосомах. Такой подход обеспечивает уникальную возможность тонкого генетического анализа и изучения хромосомной рекомбинации, ДНК-полиморфизма и др. Метод анализа индивидуальных сперматозоидов сразу нашел практическое применение в судебной медицине, так как HLA-типирование гаплоидных клеток позволяет определять отцовство или выявлять преступника (комплекс HLA представляет собой набор генов главного комплекса гистосовместимости человека; локусы комплекса HLA - наиболее полиморфные из всех известных у высших позвоночных: в пределах вида в каждом локусе существует необычайно большое число разных аллелей - альтернативных форм одного и того же гена).
Используя ПЦР, можно выявлять правильность интеграции чужеродных генетических структур в заранее определенный район генома изучаемых клеток. Суммарная клеточная ДНК отжигается с двумя олигонуклеотидными затравками, одна из которых комплементарна участку хозяйской ДНК вблизи точки встраивания, а другая - последовательности интегрированного фрагмента в антипараллельной цепи ДНК. Полимеразная цепная реакция в случае неизмененной структуры хромосомной ДНК в предполагаемом месте встройки приводит к образованию фрагментов одноцепочечной ДНК неопределенного размера, а в случае запланированной встройки - двухцепочечных фрагментов ДНК известного размера, определяемого расстоянием между местами отжига двух праймеров. Причем степень амплификации анализируемого района генома в первом случае будет находиться в линейной зависимости от количества циклов, а во втором - в экспоненциальной. Экспоненциальное накопление в процессе ПЦР амплифицируемого фрагмента заранее известного размера позволяет визуально наблюдать его после электрофоретического фракционирования препарата ДНК и делать однозначное заключение о встройке чужеродной последовательности в заданный район хромосомной ДНК.
Заключение
Самое широкое распространение метод ПЦР в настоящее время получил как метод диагностики различных инфекционных заболеваний. ПЦР позволяет выявить этиологию инфекции даже если в пробе, взятой на анализ, содержится всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР широко используется в ранней диагностики ВИЧ-инфекций, вирусных гепатитов и т.д. На сегодняшний день почти нет инфекционного агента, которого нельзя было бы выявить с помощью ПЦР.
Список использованной литературы
1.Падутов В.Е., Баранов О.Ю., Воропаев Е.В. Методы молекулярно - генетического анализа. - Мн.: Юнипол, 2007. - 176 с.
2.ПЦР "в реальном времени"/ Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др.; под ред. д. б. н. Д.В. Ребрикова; предисл. Л.А. Остермана и акад. РАН и РАСХН Е.Д. Свердлова; 2-е изд., испр. и доп. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.
.Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. - М.: Наука, 2005. - В 2 т
.Б. Глик, Дж. Пастернак Молекулярная биотехнология. Принципы и применение 589 стр., 2002 г.
5.Щелкунов С.Н.
Под редакцией А.А. Ворбьева
Http://ru. wikipedia.org
Http://scholar. google.ru
.
.
Http://www.med2000.ru/n1/n12. htm
12.http://prizvanie. su/
Нужна помощь по изучению какой-либы темы?
Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку
с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.
Часто используется в качестве экспресс-метода для индикации и идентификации вирусов.
Впервые этот метод разработал К. Мюллис (США) в 1983 т. Благодаря высокой чувствительности, специфичности и простоте выполнения его широко применяют в генетике, судебной медицине, диагностике и других областях.
Суть метода - амплификация, т. е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК in vitro. В этом методе действуют матричный механизм и принцип комплементарности. Две одинарные полинуклеотидные цепи (нуклеиновой кислоты) способны связываться водородными связями в одну двуспиральную, если последовательности нуклеотидов одной точно соответствуют последовательности нуклеотидов другой так, что их азотистые основания могут образовывать пары аденин-тимин и гуанин-цитозин.
ПЦР основана на амплификации ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймер - это фрагмент ДНК, состоящий из 20-30 нуклеотидов. Эти праймеры (затравки) комплементарны противоположным цепям ДНК. При синтезе ДНК праймеры встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК.
Обычно ПЦР ставят в 25-40 циклов. Каждый цикл включает три этапа: первый - денатурация при 92-95 °С. При этом две цепи ДНК расходятся; второй - отжиг, или присоединение праймеров при 50-65 °С; третий - элонгация, или полимеризация при 68-72 °С, при этом ДНК-полимераза осуществляет комплементарное достраивание цепей ДНК-матрицы с помощью четырех видов нуклеотидов. В результате одного цикла происходит удвоение искомого генетического материала. Образовавшиеся в первом цикле цепи ДНК служат матрицами для второго цикла и т. д. После первого цикла амплифицируется только фрагмент между двумя праймерами. Таким образом, идет удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40 циклов насинтезировать миллионы (2 n) фрагментов ДНК - количество, достаточное для индикации их различными методами (методом гибридизационных зондов, содержащих определенную метку, электрофорезом и т. д.). Чаще для этой цели используют метод электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.
В ПЦР из участков ДНК возбудителя используют праймеры, которые имеют уникальную последовательность нуклеотидов, характерных только для определенного возбудителя.
Методика постановки ПЦР сводится к следующему: из исследуемого материала выделяют ДНК-матрицу; в пробирке соединяют выделенную ДНК с амплификационной смесью, в которую входят ДНК-полимераза, все 4 вида нуклеотидов, 2 вида праймеров, MgCl, буфер, деионизированная вода и минеральное масло. Затем пробирки помещают в амплификатор, и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду возбудителя. Результаты регистрируют чаще методом электрофореза в 1-2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и выявляется в виде светящихся полос при облучении геля УФ-лучами на трансиллюминаторе. Все процедуры ПЦР занимают 1-2 рабочих дня.
С целью повышения специфичности и чувствительности ПЦР применяют различные варианты: гнездовую ПЦР; ПЦР с «горячим стартом» с использованием парафиновой прослойки или блокады активных центров полимеразы моноклональными антителами. Кроме того, некоторые фирмы выпускают лиофилизированные наборы реагентов для проведения амплификации ДНК, которые позволяют ускорить процесс проведения ПЦР и уменьшить возможность появления ложноположительных результатов.
В настоящее время внедряется новая технология ПЦР-ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальная особенность - мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить предъявляемые к ПЦР требования лаборатории. ПЦР в реальном времени используют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести полный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способа детективировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.
Система детекции продукта в полимеразной цепной реакции «real-time» (мониторинговая ПЦР) позволяет цикл за циклом следить за накоплением амплифицированной ДНК. Система включает и себя олигонуклеотидный зонд, который способен присоединяться (гибридизироваться) к внутреннему сегменту ДНК-мишени. На 5′-конце зонд помечен флуоресцентным красителем-репортером (reporter dye), а на 3′-конце - блокатором (quencher dye). По мере накопления продукта ПЦР зонд гибридизируется к нему, однако свечения не происходит из-за близости между репортером и блокатором. В результате копирования последовательности полимераза достигает 5′-конца зонда. 5’-3′-экзонуклеазная активность полимеразы отсоединяет флуоресцентную метку с 3′-конца пробы, тем самым освобождая флуоресцирующий репортер от его связи с блокатором сигнала, что и приводит к увеличению флуоресценции. Уровень флуоресценции, таким образом, пропорционален количеству специфичного продукта реакции. Важно, что результаты ПЦР регистрируются по наличию флуоресценции в закрытых пробирках и, таким образом, решается еще одна из основных проблем этого метода - проблема контаминации ампликонами.
Достоинства ПЦР: быстрота анализа; высокие чувствительность и специфичность; минимальное количество исследуемого материала; простота в исполнении и возможность полной автоматизации.
Ввиду того что чувствительность ПЦР может достигать до детекции одной копии ДНК-матрицы, существует высокая степень опасности получения ложноположительных результатов. Поэтому генно-диагностической лабораторией при постановке ПЦР необходимо неуклонно выполнять специальные требования к планировке и режиму работы.
ПЦР является одним из дополняющих методов, существующих в вирусологической диагностике. Эта реакция очень важна для диагностики вирусных инфекций, когда вирусные антигены или вирусспецифические антитела не могут быть обнаружены и когда присутствие вирусной нуклеиновой кислоты может быть единственным свидетельством заражения, особенно при латентно протекающих и смешанных инфекциях.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
С.В. Поспелова, М.В. Кузнецова
Полимеразная цепная реакция
С.В. Поспелова – канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, М.В. Кузнецова – канд. биол. наук, сотрудник ИЭГМ УрО РАН
Поспелова, С.В.
Предназначены для самостоятельной работы студентов всех факультетов: лечебного, педиатрического, медико-профилактического, стоматологического и факультета высшего сестринского образования (ФВСО) медицинской академии.
Рецензент:
зав. кафедрой биологии, экологии и медицинской генетики ПГМА, профессор А.Б. Виноградов
Печатается по решению центрального координационного
методического совета ГОУ ВПО ПГМА
им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава
УДК 616-078.33
© Поспелова С.В., Кузнецова М.В., 2007
© ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, 2007
Полимеразная цепная реакция в клинической
микробиологической диагностике
Современная медицина успешно использует достижения естественных наук, интенсивно применяет новые технологии для диагностики и лечения заболеваний. В последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий. Применение этих методов не только в научных целях, но и в практической лабораторной диагностике стало возможным в немалой степени благодаря созданию в середине 80-х годов процесса искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему стремительному развитию этой технологии, в настоящее время известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Менее чем за 15 лет своего существования ПЦР сделала рутинным анализ специфических ДНК-последовательностей многих патогенных микроорганизмов. Универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для решения различных задач клинической диагностики, таких как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, молекулярное типирование и исследование свойств патогенных микроорганизмов, анализ мутаций, связанных с генетическими заболеваниями у человека, идентификация личности человека.
Что такое ПЦР?
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro (рис. 1). Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК «с нуля», ей необходима короткая «затравочная» цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.
В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «ограничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов:
1) денатурации, или «плавления» двуцепочечной ДНК: перед началом реакции ДНК-мишень является двуцепочечной, при температуре 94-95 0 С комплиментарные цепи ДНК расходятся - переходят в одноцепочечное состояние;
2) связывания (отжига) праймеров: при температуре, оптимальной для выбранных праймеров, происходит их связывание с комплиментарным участком матричной ДНК;
3) элонгации, или удлинения цепи: ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к праймерам, синтезируя новые цепи ДНК, которые становятся мишенью для праймеров в последующих циклах ПЦР.
Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси (см. рис. 1).
Рис. 1. Основные этапы цикла ПЦР
Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле. Если на начальном цикле в исследуемом материале была только одна ДНК-мишень, после первого цикла будет уже две копии, после двух циклов – 4 копии, результатом третьего цикла будет 8 копий, а тридцать пятого – уже 68 биллионов копий (рис. 2).
Рис. 2. Процесс многократного копирования
ДНК-мишени в ходе последовательно
сменяющихся циклов
Основным методом анализа продуктов реакции, который традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера, является метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем, специфичным к ДНК, например бромистым этидием (рис. 3).
Контроль – различные фрагменты ДНК с известным количеством составляющих их нуклеотидов. Известно, что дистанция между различными фрагментами имеет логарифмическую зависимость от их размера, массы. Линия 1 – обнаружены ПЦР-фрагменты длиной приблизительно 1850 оснований. Линия 2 и 4 – фрагменты длиной около 800 оснований.
Рис. 3. Анализ продуктов реакции методом
гель-электрофореза
Линия 3 – не выявлены искомые фрагменты, отрицательный результат реакции. Линия 5 – множественные линии сформировались потому, что праймеры оказались комплиментарны к нескольким фрагментам ДНК различной длины: около 550, 800 и 1500 оснований.
Усовершенствование технологии ПЦР
Первоначально для осуществления ПЦР использовали обычные ДНК-полимеразы, которые подвергались температурной инактивации в каждом цикле на этапе денатурации ДНК. Полимеразу приходилось многократно добавлять в реакционную смесь, что было довольно трудоемко и не позволяло автоматизировать процесс.
В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термостабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойствами, достаточно велико. Наиболее часто используется Taq-полимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus. Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают, как правило, стабильную воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике.
Техническое оформление смены температуры реакционной смеси также стремительно развивалось в последнее время. Сначала ПЦР осуществлялась при помощи трех водяных бань, настроенных на разную температуру: для денатурации ДНК, отжига праймеров и полимеризации. Пробирки переносились из одной водяной бани в другую «по кругу», благодаря чему происходила смена температуры на разных этапах цикла. Существовали и варианты приборов, где в водяную баню, в которой находились пробирки с реакционной смесью, поочередно подавалась вода разной температуры. Смена циклов в этих случаях занимала много времени, и процесс плохо поддавался автоматизации. Для осуществления ПЦР в основном используются приборы (термоциклеры), которые изменяют температуру автоматически на основе заданной программы. В термоциклерах пробирки с реакционной смесью помещаются в металлический блок, температура которого изменяется с большой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР.
Современные термоциклеры приспособлены для использования специальных тонкостенных пластиковых пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном итоге дополнительно сократить время проведения реакции.
Таким образом, стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1-3 ч. Многие приборы позволяют программировать специальные усложненные температурные профили, необходимые для специфических модификаций процесса ПЦР.
Параллельно с усовершенствованием технологии ПЦР развивались и методы анализа продуктов реакции. Метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем, специфичным к ДНК, например бромистым этидием, традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера. Использование гибридизации с внутренними ДНК-зондами позволяет в ряде случаев значительно повысить чувствительность и специфичность детектирования ПЦР-продуктов. Благодаря отсутствию необходимости в подготовке и проведении электрофоретического разделения, возможности автоматизации для анализа большого количества образцов и использования нерадиоактивного формата детектирования, этот метод становится все более распространенным. В некоторых случаях применение специальных флюоресцентных «маркеров» позволяет контролировать проведение амплификации или детектирование конечных продуктов ПЦР непосредственно в реакционной пробирке.
Использование ПЦР
в медицинской микробиологии
Среди множества различных направлений клинической диагностики медицинская микробиология занимает, пожалуй, лидирующее место по количеству и разнообразию приложений, использующих технологию ПЦР. Внедрение в практику этого метода наряду с серологической диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или в культуре клеток.
Возможности и ограничения традиционных
методов культивирования
Традиционный для микробиологических лабораторий культуральный метод диагностики, как правило, хорошо оправдывает себя для выявления и исследования таких свойств, как чувствительность к антибиотикам, вирулентность легкокультивируемых микроорганизмов. Однако некоторые микроорганизмы (пневмококки, гемофилы, нейссерии, микоплазмы, облигатные анаэробы и др.) могут быть чрезвычайно чувствительными к условиям забора клинического материала, транспортировки и культивирования, наличию специальных факторов роста или способны к размножению in vitro только в культуре клеток (вирусы, хламидии, риккетсии).
Медленный рост на искусственных средах таких микроорганизмов, как микобактерии и грибы, является еще одним естественным ограничением, связанным с использованием культурального метода для диагностики этих микроорганизмов. Кроме того, работа с живыми культурами выделенных возбудителей, причем не только особо опасных, но иногда и условно-патогенных, может представлять угрозу для здоровья персонала лаборатории.
Среди возбудителей болезней человека известны также и некультивируемые виды бактерий, например Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, и многие виды вирусов, включая вирусы папилломы человека и гепатита С, попытки выращивания которых в клеточной культуре пока остаются безуспешными. Наконец, даже при успешном культивировании существует необходимость последующей идентификации выделенных микроорганизмов.
Традиционные микробиологические методы идентификации основаны на использовании различных фенотипических тестов, таких как выявление специфической ферментативной активности, способности метаболизировать сахара или поддерживать рост на средах с селективными добавками. Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.
Использование ПЦР для прямой диагностики
и идентификации возбудителей
инфекционных заболеваний
В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления С. trachomatis.
Имеется также возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей. Такая модификация получила название множественной ПЦР (multiplex PCR). Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. Так, например, описаны варианты применения множественной ПЦР для одновременного обнаружения двух (С. trachomatis и N. gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта) или даже четырех возбудителей (И. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis и A. otitidis при хроническом гнойном отите).
Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с помощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших систематических групп (рода, семейства), так и крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S рРНК), которые имеют сходную структуру у различных прокариотических микроорганизмов.
Использование праймеров, комплементарных консервативным участкам этих генов, позволяет амплифицировать ДНК большинства видов бактерий. Полученные в результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем проанализированы с помощью различных лабораторных методов с целью идентификации бактерий, которым они принадлежат. Наиболее точным методом «молекулярной» идентификации является определение полной нуклеотидной последовательности (секвенирование) амплифицированной ДНК и сравнение ее с соответствующими последовательностями известных видов.
Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих описанный принцип идентификации, на практике обычно используются менее трудоемкие и дорогостоящие методы, которые тем не менее позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК-фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами (метод ПДРФ (RFLP) – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ), или на определении электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод SSCP-одноцепочечный конформационный полиморфизм ).
ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует однако отметить, что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов.
Методы молекулярного типирования
микроорганизмов на основе ПЦР
ПЦР широко используется не только для диагностики и идентификации, но и для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипированием) генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. Описано много методов генотипирования, которые можно рассматривать как производные технологии ПЦР.
Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, общим для большинства из них является использование гель-электрофореза для разделения фрагментов ДНК разной длины, полученных от каждого отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов.
Использование ПЦР для выявления лекарственной
устойчивости у микроорганизмов
В последнее время ПЦР все чаще используется для исследования различных свойств патогенных микроорганизмов, в частности для выявления устойчивости отдельных видов возбудителей к определенным лекарственным препаратам. Как правило, использование ПЦР для определения чувствительности микроорганизмов является целесообразным лишь в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам с помощью культуральных методов занимает обычно от 4 до 8 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов в подобных случаях могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов. Исследование молекулярных механизмов лекарственной устойчивости М. tuberculosis и некоторых других возбудителей позволило разработать методы на основе ПЦР для быстрого выявления генетических маркеров резистентности.
Для подобного анализа обычно используется ДНК или РНК возбудителя, выделенного в чистой культуре. Однако в некоторых случаях имеется возможность прямого ПЦР-анапиза на антибиотикорезистентность без предварительного культивирования возбудителя. Исследуемый образец клинического материала при этом используется как источник ДНК-мишени для ПЦР, а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу с целью выявления мутаций, связанных с антибиотикорезистентностью. Разработан, например, метод, позволяющий с помощью ПЦР обнаружить у пациентов, страдающих туберкулезным менингитом, устойчивость возбудителя к рифампицину.
Существуют, однако, естественные ограничения для использования генетических методов оценки лекарственной устойчивости микроорганизмов:
Данные о конкретных генетических механизмах резистентности могут отсутствовать;
Резистентность к определенным препаратам часто бывает связана с различными механизмами и мутациями в различных генах, которые независимо влияют на фенотип.
Например, резистентность грамотрицательных бактерий к аминогликозидным антибиотикам может быть вызвана продукцией различных аминогликозидмодифицирующих ферментов или изменением проницаемости клеточной стенки. В этом случае результаты ПЦР-анализа, который всегда характеризует строго определенный специфический участок ДНК, не могут служить основанием для оценки чувствительности микроорганизма в целом.
Кроме того, отсутствие международных стандартов и рекомендаций по использованию ПЦР для определения чувствительности к антимикробным препаратам является дополнительным фактором, ограничивающим возможность широкого применения этого подхода в практической диагностике.
