4402 0
К сожалению, и в настоящее время можно констатировать, что диагностика грибковых заболеваний нередко бывает несвоевременной (зоны поредения волос, шелушение часто принимаются за «перхоть», «сухость»). При этом субьективные ощущения (зуд, боль и др.) в очагах поражения зачастую не бывают, и больные в силу этого долгое время не обращаются на прием к специалисту.
Изменения ногтей (уродливые, крошатся, истонченные) расцениваются как «ониходистрофии» после ушиба, отморожений и др. В то же время (даже изолированные поражения, в т.ч.ногтей) могут вести к формированию аллергической перестройки организма, влиять на кровеносные и лимфатические сосуды и др. Больные при этом неопределенно долго остаются источником распространения грибковой инфекции. В связи со сказанным неизменно актуальной является своевременная лабораторная диагностика микозов, проведение возможно раннего лечения.
Разнообразие клинических вариантов грибковых заболеваний, преимущественно встречающихся у человека, а также особенности микробиологии, морфоструктуры, иммунологических и иных параметров различных видов(и родов) грибов обусловило наличие значительного количества методов диагностики микозов; следует отметить, что имеющиеся методы непрерывно совершенствуются и (сравнительно недавно) имеют своеобразный уклон в сторону иммунологических и молекулярно-генетических тестов.
С другой стороны, культуральные исследования и до сих пор «находятся в разряде стандартов, близких к золотым» и применяются для подтверждения сомнительных результатов иных исследований; существует мнение, что сочетание культурального и молекулярно-генетического методов при «сомнительных» в диагностическом плане формах микозов (особенно диссеминированных, на фоне иммуносупрессии любого генеза, с поражением внутренних органов и др.) является одним из наиболее достоверных способов регистрации микотической природы процесса.
Не следует, однако, пренебрегать «старыми» методиками, в частности бактериоскопией (особенно припервичном обследовании), тем более, что в повседневной практике микроскопическая «верификация» микоза во многих дерматологических учреждениях применяется наиболее широко в сравнении с иными тестами.
С учетом значительного роста количества аллергических проявлений на коже (а иногда и висцеральных) — при длительном, хроническом, периодически обостряющемся течении микоза (кожи, ногтей и др.) целесообразна постановка аллергологических тестов, позволяющих выявить степень сенсибилизации организма, в т.ч, при сочетанной грибково-бактериальной инфекции; данный факт может повлиять на специфику лечения у конкретного больного — например, определить рациональное назначение антимикотиков и десенсибилизирующих средств и др.
Традиционно, предположительный диагноз грибкового заболевания ставится на основании клинических проявлений и подтверждается лабораторными исследованиями.
В данном разделе книги мы кратко приводим базовые методы регистрации микозов (независимо от их локализации), учитывая «тип исследования и взятый материал». Следует отметить, что полиморфизм клинических проявлений микозов (в т.ч. с аллергическим компонентом) обусловливает разнообразие патологического материала, подлежащего исследованию. При этом успех поиска элементов гриба зависит от правильного взятия его.
Так, периферическая зона эритемато-сквамозных, часто фигурных высыпаний более богата мицелием, спорами гриба; на волосистых участках поражения берутся скрюченные, белесоватые, обесцвеченные, тусклые волосы или их обломки — «пеньки» (забор волос целесообразно контролировать с помощью лампы Вуда). Определенных навыков требует забор материала (с помощью иглы) из т.н. «черных точек» — темных роговых конусов в устьях фолликулов.
В повседневной практике обычно исследуются чешуйки кожи(собираются путем соскоба, мазка, с использованием липкой ленты), соскоб измененных ногтей, зона подногтевого гиперкератоза, а также отделяемое слизистых оболочек. По показаниям исследуют мокроту, лаважную жидкость, мочу (у пациентов с некатетеризированным мочевым пузырем); моча из мочеприемников, подкладных суден не может быть взята для исследования.
Диагностическое значение имеет также кровь (для культурального исследования, а также ИФА, ПЦР), ликвор и иные биожидкости организма (плевральная, внутрисуставная, внутрибрюшинная — в т.ч. собранные методом аспирации или дренирования); в отдельных случаях (в зависимости от топического диагноза) имеют значение желчь, фекалии, пунктаты подкожных абсцессов, отделяемое свищей (особенно при глубоких микозах). Даже несложные диагностические тесты требуют точного соблюдения ряда условий.
Для диагностики грибковых заболеваний в настоящее время применяются методы:
- микроскопия; основана на обнаружении возбудителя в исследуемом материале, в т.ч. в тканях человека;
- культуральное исследование с последующим микроскопическим изучением культуры гриба;
- гистологическое исследование (г.о. при глубоких микозах);
- иммунные и молекулярные методы.
Микроскопическая диагностика предполагает изучение неокрашенных (нативных) и окрашенных препаратов. Данный метод, как отмечалось, более всего распространен в дерматологической практике ввиду сравнительной несложности и дешевизны, но, с другой стороны, бывает недостаточно чувствительным, требует в части Случаев повторных анализов, подтверждения иными методиками.
Так, при исследовании неокрашенных препаратов помимо элементов гриба, можно обнаружить эпителиоциты, клетки крови,различные загрязнения из внешней среды, что затрудняет поиск возбудителя микоза, требует дополнительной «подготовки» материала — т.н. «просветления» его (мацерации), концентрирования, разведения и т.п.
Все же прямая микроскопия нативных препаратов позволяет достаточно быстро поставить диагноз микоза, определить, на какие питательные среды (при необходимости) следует засевать материал, существует мнение, что положительный результат ее может оставаться единственным лабораторным подтверждением микоза при отрицательном ответе в культуре (А.Ю.Сергеев, Ю.В.Сергеев, 2003).
Среди различных вариантов «просветления» препаратов наиболее распространенным является добавление к исследуемому материалу КОН или NаОН (чаще используется для обнаружения грибов в чешуйках кожи, волосах, а также ряда возбудителей глубоких микозов в мокроте, биоптатах).
Для мацерации измельченных и помещенных на предметное стекло чешуек проводится 10-20% раствором едкого натра (или калия) — 1-3 капли, в течение 10-20 мин; препарат слегка придавливают покровным стеклом, для более скорой мацерации — подогревают на пламени до появления паров. Просмотр ведут сначала под малым увеличением, затем — под большим (сухая система).
Правильно приготовленный препарат, не подвергшийся грубым механическим, термическим и химическим воздействиям, представляет картину гомогенной массы, состоящей из эпителиоцитов, продуктов клеточного распада элементов гриба — нитей мицелия и спор.
Измененные волосы помещают на предметное стекло с 10-30% щелочью и обрабатывают тем же способом, но более длительно - от 20 мин до 3-4 ч. При обильном содержании пигмента рекомендуют предварительно обесцветить волосы 5% раствором перекиси водорода. Придают значение обнаружению элементов гриба, а также расположению их по отношению к волосу.
Подготовка материала из патологически измененных ногтей (лучше тонкий порошок, полученный соскобом из глубины очага) проводится аналогично, но с использованием 30% едкого натра, обязательным осторожным подогреванием на пламени до легких паров и экспозицией около 1ч (иногда до нескольких часов). Обработанные щелочью препараты не следует хранить более 1,5-2ч ввиду их «порчи» (кристаллизация реагента, снижение диагностической достоверности определяемой микроскопической картиной).
Вместо КОН или №ОН можно использовать: а)раствор смесь КОН с 15% ДМСО; б) смесь фенола (2 части) с хлоралгидратом (2 части) и молочной кислотой (1 часть); в) калькофлюоровый белый, имеющий сродства к хиги-ну и целлюлозе; для исследования необходим люминесцентный микроскоп (наблюдается голубое или зеленое свечение, что зависит от применяющегося фильтра). При исследовании ликвора (при подозрении на криптококкоз) часто использовалась окраска с тушью.
Кулага В.В., Романенко И.М., Афонин С.Л., Кулага С.М.
Грибковые инфекции находятся на втором месте в списке самых распространенных заболеваний, поражающих не только кожные покровы, но и слизистые оболочки и даже внутренние органы. Главным условием избавления от недуга стала комплексная терапия, которая подбирается лечащим врачом на основании результатов лабораторной диагностики. Сдача биоматериала на анализ является нужной процедурой, так как только с ее помощью можно установить стадию развития болезни и ее тип. В противном случае самостоятельное лечение принесет вред и переведет микоз в запущенную стадию.
Человек, зараженный грибком, может на протяжении нескольких месяцев не знать о своей проблеме, потому что на начальном этапе развития инфекции признаков заболевания практически нет. После перехода микоза в активную фазу у больного начинают проявляться следующие симптомы:
Иногда к ним присоединяется высокая температура, общее недомогание и боль при надавливании на место локализации грибка.
При обнаружении каких-либо проявлений присутствия патогенной микрофлоры внутри организма необходимо немедленно записаться на прием к дерматологу или инфекционисту.
В процессе дифференциальной диагностики главное место занимает первичный осмотр больного. В этом случае при посещении врача пациент обязан с точностью описать симптоматику заболевания и ответить на все вопросы, которые задаст доктор. Профессиональный медик должен спросить следующее:
После получения ответов врач обязан провести визуальный осмотр кожных покровов или слизистых оболочек. Во время этой процедуры он оценивает масштаб пораженных тканей, выявляет наличие их повреждений, а также ставит первичный диагноз.
По завершению физикальной диагностики доктор выписывает пациенту направление на анализы. Обычно для этого больному следует сдать кровь, соскоб с кожи или фрагмент ногтевой пластины (если на ней есть признаки онихомикоза). Кроме того может потребоваться сдача сразу двух образцов, например частички ногтя и кусочка тканей вокруг него.
На сегодняшний день существует несколько эффективных способов диагностирования микоза. Выбор той или иной методики зависит от того, где будет проходить исследование (частная клиника или государственная больница), и какими средствами располагает пациент. Сразу стоит сказать, что данная процедура не относится к мероприятиям, предусмотренным ОМС (обязательное медицинское страхование), поэтому больному придется за нее заплатить.
Микроскопия представляет собой самый распространенный способ выявления грибковой инфекции и определения вида патогенной микрофлоры. С ее помощью можно обнаружить возбудитель заразы только внутри структуры тканей кожи или ногтевой пластины.
На точность результата влияет правильное взятие образца, поэтому любая процедура должна проводиться в соответствии с требованиями МОЗ. Забор биоматериала заключается в аккуратном соскобе инфицированных клеточек с места локализации грибковой инфекции. Лаборант обязан выполнять это мероприятие с использованием медицинских перчаток и стерильного скальпеля.
Далее образец помещается в раствор калиевой щелочи, а после наносится на предметное стекло микроскопа. При необходимости клетки тканей окрашиваются специальным ферментом.
В норме биоматериал не должен содержать никаких представителей патогенной микрофлоры. Если же в нем находятся единичные клеточки инфекции, то это может сказать не об активной фазе заболевания, а о ее скрытом (латентном) состоянии.
На средней и запущенной стадии развития грибка в образце тканей выявляются:
В завершении лабораторной диагностики устанавливается концентрация заразы, ее тип и вид возбудителя.
Исследование биоматериала методом микроскопии – это очень продолжительная процедура, которая занимает от двух дней до четырех недель. Это считается ее главным недостатком. Однако, несмотря на долгое ожидание результатов анализов, практически в 97% случаев диагноз является достоверным. Да и к тому же, стоит эта услуга гораздо дешевле экспресс-методов.
При сдаче фрагмента ногтевой пластины на анализ нужно предварительно очистить его от косметического лака. Наличие сторонних веществ в образце биоматериала может вызвать затруднение при диагностировании грибка ногтей.
Иммунологический ферментный анализ крови на грибок предназначен для обнаружения микозов, которые поразили не только кожные покровы, но и внутренние органы (например, кокцидиоидоз или гистоплазмоз). Очень часто данную методику применяют тогда, когда по некоторым причинам у пациента не получается взять образец тканей для микроскопии.
Иммунологическая диагностика основывается на установлении титра антител к определенному типу грибковой инфекции. В основном для этого применяют определение IgG к аспергиллезу и кандидозу. Точность данного анализа составляет примерно 80%, но иногда он может дать положительный результат при отсутствии глубоких микозов. Это обычно случается тогда, когда пациент болен запущенной формой молочницы или грибком слизистой оболочки рта.
В отличие от микробиологического исследования, для проведения ИФА необходима только венозная кровь больного. Ее берут рано утром или через 4 часа после последнего приема пищи. Никакой особой подготовки к проведению анализа не требуется.
Результаты лабораторной диагностики становятся известными спустя несколько суток после сдачи биоматериала. Очень редко длительность ожидания может составить 5 дней. На скорость исследования зачастую влияет качество оборудования, установленного в лаборатории, и необходимость дополнительного изучения образцов крови клиента.
По завершению процедуры пациенту выдается заключение, в котором указывается одно из следующих значений:
В лабораториях, где применяются современные технологии для проведения иммуноферментного анализа, также выявляют показатель концентрации клеток микоза. Об этом указывается в бланке заключения. Это пункт не является обязательным, но его наличие поможет врачу подобрать более точное лечение.
Полиразмерная цепная реакция – это самый лучший метод диагностирования любых инфекционных заболеваний, в том числе и грибка. Данный способ обладает рядом преимуществ, среди которых нужно выделить:
Единственным недостатком ПЦР-теста стала узкая направленность. Это означает, что для того, чтобы диагностировать микоз, нужно с точностью знать место его локализации.
Полиразмерная цепная реакция может выявить не только тип возбудителя заболевания, но и его концентрацию в организме пациента. Для этого потребуется подождать около суток. Иногда, при отсутствии каких-либо неблагоприятных факторов, получить результаты анализа можно в день сдачи биоматериала, через 5-6 часов. Скорость проведения исследований в этом случае зависит только от опытности медперсонала, правильности забора образцов тканей, а также от того, насколько загружена лаборатория работой.
Люминесцентная диагностика микозов основывается на высвечивании участков кожи, которые поражены патогенной микрофлорой рода Микроспорум, ультрафиолетовой лампой. Данная методика относится к экспресс-способу выявления ряда кожных инфекций и применяется при обнаружении симптомов лишайных заболеваний.
Диагностика грибковой инфекции при помощи ультрафиолетового излучения не считается основным способом выявления типа заболевания. Она относится к вспомогательным методам и не является обязательной, поэтому при желании от нее можно отказаться.
В процессе осмотра пациента используется лампа Вуда, которая испускает УФ лучи и заставляет продукты жизнедеятельности микоза светиться ярким светом. Цвет свечения зависит от того, какой вид возбудителя грибка поразил организм человека:
Конечно, такая методика не обладает высокой точностью и не может дать ответы на многие вопросы, поэтому ее используют в качестве дополнительного способа диагностирования грибка или же не назначают вовсе.
Если же доктор считает, что люминесцентное исследование может сыграть немаловажную роль в составлении курса лечения микоза, то пациент должен знать о следующих правилах подготовки к обследованию при помощи ультрафиолетовой лампы:
Финансовая сторона проведения исследований грибковой инфекции зависит от нескольких факторов:
Ниже представлены средние цены на диагностику в Московской области:
Все цены указаны без учета процедуры взятия биоматериала на анализ. Для того чтобы медперсонал взял кровь или соскоб, потребуется заплатить примерно 150 руб. в государственной больнице и около 200-250 руб. в частной клинике. В некоторых крупных медицинских центрах эта процедура бесплатная, но об этом нужно узнавать заранее.
После установления типа возбудителя микоза и прохождения курса лечения человеку очень важно соблюдать правила профилактики. Они помогут не только закрепить полученный результат, но и предотвратят повторный рецидив инфекции.
Кроме этого потребуется постоянно принимать витаминно-минеральные комплексы или включить в свое меню большое количество растительной пищи. Это позволит укрепить иммунную систему, которая продолжит бороться с различными представителями патогенной микрофлоры, попадающей в организм извне.
Для исследования можно брать чешуйки, пораженные волосы, покрышки пузырьков, гной из открытых очагов поражения, ногтевые пластинки, мокроту, кал, мочу, рвотные массы, желчь, тканевую жидкость. От правильного взятия материала во многом зависит успех микроскопического исследования при дерматомикозах. Элементов гриба бывает обычно больше на свежих нелеченных, но уже сформированных участках поражения. При микозах гладкой кожи для исследования берут чешуйки периферических участков очага путем соскабливания скальпелем. У больных дисгидрозом стоп, кистей ножницами или лезвием безопасной бритвы срезают покрышки пузырьков или бахромки отслоенного эпителия. При дерматомикозах с поражением длинных и пушистых волос материал берут эпиляционным пинцетом, иногда - острием скальпеля, если волосы обломаны на уровне кожи. При инфильтративно-нагноительных процессах в периферии очага отбирают волосы, которые плавают в гное. Гной берут фолькмановской ложечкой и переносят в чашку Петри или на часовое стекло. Препаровочной иглой вылавливают пораженные волосы и размещают на предметное стекло. Таким же образом собирают гной из открытых очагов поражения, свищей, а из закрытых - путем пункции шприцом.
Соскобы с пораженной слизистой оболочки берут стерильным шпателем, петлей, ножницами, маникюрными щипцами, а из более глубоких слоев - бормашиной.
При глубоких микозах для исследования берут мокроту, желчь, мочу, тканевую жидкость и вносят в стерильные стеклянные банки с притертой пробкой. Иногда используют биопсию кусочков ткани, внося их в стерильные чашки Петри или стеклянные банки. Взятый материал пересылают в лабораторию вместе с сопроводительным направлением, где указывают фамилию, имя и отчество больного, возраст, предварительный диагноз, локализацию поражения, характер и дату взятия материала.
Наряду с этим, в препарате имеются негрибковые элементы: пузырьки воздуха, капельки жира.
Для диагностики глубокого микоза, чаще всего, готовят и исследуют окрашенные препараты, используя в качестве материала гной, выделения свищей, язв, соскобов грануляций и т.д. Материал наносят тонким слоем на предметное стекло, грануляционную ткань предварительно расщепляют препаровочной иглой. Приготовленные мазки фиксируют смесью Никифорова, 5-процентным водным раствором хромовой кислоты или смесью Кармует (10 г ледяной уксусной кислоты, 60 мл этилового спирта и 30 мл хлороформа), потом сушат и красят.
Окраска зависит от цели исследования. Чаще всего красят по Граму, Граму- Вельшу, Циль-Нильсену, Романовскому-Гимзе, Сабуро, Адамсону и др.
Многообразие клинических проявлений наиболее распространенных дерматомикозов (трихофития, микроспория, эпидермофития, руброфития), их различия в связи с локализацией процесса (волосистая часть головы, гладкая кожа, складки, ногти) усложняют диагностику. Поэтому в ряде случаев необходимо культуральное подтверждение диагноза. Правильное установление диагноза облегчает лечение, а главное - позволяет целенаправленно проводить эпидемиологические и профилактические мероприятия.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МИКОЗОВ
Взятие материала для лабораторного исследования на грибок.
1.ОСТ 42-21-2-854: приказ № 222/80 от 27.06.00
2.Оснащение: пинцет, предметные стекла, ножницы, ложка фолькмана.
4.Показания: грибковые заболевания.
5.Осложнения: нет.
Подготовка процедурного кабинета:
Смена растворов.
Приготовить:
-1%р-р хлорамина для ветоши
-3%р-р хлорамина – для дезинфекции перевязочного материала и пинцетов
- моющий р-р (156 мл. перекиси водорода + 5 г. моющего порошка + 839 мл. дисцилированной воды) - для обработки пинцетов
- 6% р-р перекиси водорода – для обработки перчаток.
Алгоритм выполнения манипуляции.
Нужно взять пинцет, предметное стекло, ложку фолькмана, ножницы;
- пациента пригласить в перевязочную;
- пациент сидит на стуле или кушетке;
- м/с стоит.
Техника выполнения:
Из очага поражения пинцетом взять чешуйки кожи и волосы;
- взятый материал положить на предметное стекло и закрыть другим предметным стеклом.
- вымыть руки с мылом;
- взятый материал отправить в лабораторию.
СБОР МАТЕРИАЛА
Взять ножницы и предметные стекла;
- ножницами отрезать кусочек от свободного края ногтя;
- взятый материал покрыть другим предметным стеклом;
Ножницы и пинцет замочить в 3% растворе формалина.
Правильный сбор материала из пораженных ногтей - залог успешного микробиологического исследования. Забирая материал, не всегда захватывают участки ногтя, содержащие жизнеспособные грибы. Нежизнеспособные грибы в культуре, естественно, не вырастут, и их вид установить не удастся.
Участок ногтя, который надо взять, определяется формой онихомикоза.
Так, при поверхностной форме онихомикоза следует делать соскобы с поверхности ногтевой пластинки.
При самой распространенной дистальной подногтевой форме наиболее жизнеспособные грибы располагаются под ногтевой пластинкой. Материал, который направляют на исследование, должен включать не только обрезок ногтевой пластинки, но и соскоб с ногтевого ложа, из-под пластинки.
Кроме того, следует захватывать и области неизмененного ногтя, поскольку на границе между ними и пораженными участками ногтя располагаются самые активные грибы.
При проксимальной подногтевой форме брать материал трудно. В этих случаях иногда, особенно если собираются проводить гистологическое исследование или дифференциальную диагностику, предпринимают биопсию ногтя, изредка используют бормашину.
При паронихиях делают соскобы с проксимального валика и из-под него.
Во всех случаях, чтобы избежать бактериальной контаминации, перед взятием образца следует обработать ноготь этиловым спиртом.
МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Микроскопическое исследование патологического материала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах.
Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем самым делают грибы доступными для исследования.
На размягченные чешуйки кожи или ногтя, которые помещают на середину предметного стекла, наносят 1-3 капли 20 - 30% раствора КОН (NaOH). Исследуемый материал в каплях щелочи осторожно подогревают над пламенем спиртовки до появления нежного белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли. Подогревать до кипячения не следует. После подогревания каплю накрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха.
Р. А. Аравийский и Г. И. Горшкова (1995) рекомендуют просветленные и накрытые покровным стеклом препараты кожных чешуек и волос оставлять на 5 - 10 мин, а ногтевых пластинок – на 30 - 40 мин до микроскопирования.
Просветление препаратов можно проводить без подогревания, для этого их оставляют в 20% растворе КОН на 30 - 60 мин или используют другие методы просветления патологического материала: хлораллактофенолом по Аману; лактофенолом; раствором, содержащим по 15% диметилсульфоксида и КОН в воде. Хорошие результаты получают после просветления ногтевых пластинок, помещенных в 5% раствор КОН на 24 ч, подогревания в этом случае не требуется.
Микроскопическое исследование производят на обычном лабораторном микроскопе без иммерсии.
Конденсор микроскопа должен быть опущен, диафрагма сужена. В начале препарат находят на стекле при малом увеличении (40х), последующее исследование производят при большем увеличении (100х);
детально препарат изучают при увеличении 400х. Необходимо исследовать несколько препаратов с тем, чтобы увеличить надежность анализа и избежать ложноположительных результатов.
Ошибки в микроскопической диагностике грибов могут возникнуть в связи как с дефектами приготовления препарата, так и с недостаточной опытностью лаборанта.
Дефекты изготовления прежде всего бывают связаны:
с перегреванием препарата, что может привести к выпадению кристаллов щелочи, разрушению волоса и появлению мелкозернистого распада в патологическом материале.
Линейное расположение удлиненных ровных кристаллов щелочи весьма напоминает нити септированного мицелия даже на чистом стекле без патологического материала.
Дифференциально-диагностическими признаками являются исключительное однообразие кристаллов, их стекловидная прозрачность, многогранность краев и отсутствие неразрывной связи одного элемента с другим. В сомнительных случаях рекомендуется добавить к препарату капельки слегка подогретой дистиллированной воды, которые быстро растворяют кристаллы щелочи.
За элементы гриба ошибочно могут быть приняты:
- капельки жира,
- пузырьки воздуха,
- хлопчатобумажные нити одежды
- и так называемый «мозаичный грибок».
Липиды кожных покровов, жировой распад клеток и зерна кератогиалина, особенно имеющие правильную форму, могут напоминать отдельные споры гриба. Но разнообразие формы и, главное, размеров, отсутствие внутренней структуры образований (вакуоли, оболочки) говорят против грибковой природы данных элементов. Липиды также могут попасть в препарат при взятии патологического материала с недостаточно очищенного очага поражения.
Пузырьки воздуха могут напоминать споры дрожжеподобных клеток, но в отличие от последних они окружены плотной темной оболочкой, и даже самые маленькие пузырьки воздуха всегда больше клеток гриба.
Нити от ткани носков, одежды и т. п. обычно лежат отдельно от патологического материала, они всегда больше гифов, грубее и не септированы.
«Мозаичный грибок» представляет собой артефакт, который возникает в процессе кристаллизации (возможно, за счет распада холестерина). Он имеет вид сеточки или петель, очертания которых соответствуют границам роговых чешуек, в отличие от нитей мицелия он никогда не пересекает стенки клеток эпидермиса.
В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раствором КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих темно-синих чернил фирмы Паркер (Parker"s Superchrome Blue-Black Ink).
При этой окраске гифы и споры окрашиваются в голубой цвет.
При микроскопии обнаруживают нитевидные гифы грибов или почкующиеся клетки (рис.1).
Таким образом, микроскопия дает заключение только о грибковой природе инфекции, но не о виде гриба-возбудителя.
Конечно, результативность микроскопического исследования зависит от квалификации сотрудника лаборатории.
Рис. 1. Микроскопия соскоба с ногтей, пораженных Т. rubrum. Видны гифы гриба.
КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Проводят посев материала на стандартную среду Сабуро, часто с добавками антибиотиков. В диагностике дерматофитных инфекций принято добавлять в среду Сабуро циклогексимид, подавляющий рост грибов-контаминантов, попадающих из воздуха. Существуют готовые коммерческие среды с добавками антибиотиков и циклогексимида. Следует помнить, что многие плесневые грибы-недерматофиты и некоторые виды Candida не растут на среде с циклогексимидом, поэтому рекомендуется делать посев на среду Сабуро с циклогексимидом и на среду без него. Идентификацию видов обычно проводят при микроскопическом исследовании выросшей культуры или путем пересева на селективные среды (рис. 2-15).
Рис. 2. Культура гриба Т. rubrum, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро (слева) и кукурузном агаре (справа).
Рис. 3. Культура гриба Т. mentagrophytes var. interdigitale, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.
Рис. 4. Культура гриба Candida albicans. Получена на среде Сабуро.
Рис. 5. Культура гриба Torulopsis glabrata, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.
Рис. 6. Культура гриба Ulocladium sp., выделенного из пораженных ногтей.
Рис. 7. Микроморфология Acremonium sp., выделенного из пораженных ногтей.
Рис. 8. Микроморфология Fusarium sp., вьщеленного из пораженных ногтей.
Рис. 9. Микроморфология Scopulariopsis sp., выделенного из пораженных ногтей.
Рис. 10. Микроморфология Candida albicans, выделенного из пораженных ногтей.
Рис. 11. Микроморфология Altemaria sp., выделенного из пораженных ногтей.
Рис. 12. Микроморфология Aspergillus sp., выделенного из пораженных ногтей.
Рис. 13. Микроморфология Ulocladium sp , выделенного из пораженных ногтей.
Рис. 14. Микроморфология Chaetomium sp., выделенного из пораженных ногтей.
Рис 15. Панель питательных фед для идентификации дерматофитов (слева - культура Т rubrum, справа - Т mentagrophytes var. mterdigitale).
Слева направо: среда Сабуро, среда Бакстера, среда Христенсена, кукурузный агар
Следует учесть, что некоторые плесневые грибы, в том числе дерматофиты, в культуре вырастают медленно, за 2-3 нед.
Даже при соблюдении всех правил сбора материала, при хорошем оборудовании лаборатории и высокой квалификации ее персонала число положительных результатов культурального исследования очень невелико.
По данным зарубежной литературы, процент положительных исследований не превышает 50.
Процент положительных результатов в лучших отечественных лабораториях едва достигает 30.
Таким образом, в 2 из каждых 3 случаев онихомикоза его этиологию установить не удается.
ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
В 1925 г. Margaret и Deveze обнаружили, что волосы, пораженные некоторыми дерматофитами, дают характерное свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Byда. Стекло Byда состоит из сульфата бария, содержит около 9% окиси никеля; оно пропускает лучи длиной 365 нм. В качестве источника ультрафиолетовых лучей можно использовать различные приборы. Природа свечения точно не установлена. Волос продолжает светиться после гибели гриба и после попыток экстрагировать флюоресцирующий материал горячей водой или холодным раствором бромида натрия. Интенсивность и характер свечения зависят от рН раствора. Полагают, что флюоресцирующая субстанция появляется в процессе взаимодействия гриба и растущего волоса.
Свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Вуда, характерно только для волос, пораженных грибами рода Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, изредка M. gypseum и M. nanum), a также Trichophyton schonleinii. Волосы, пораженные микроспорумами, особенно M. canis и M. audouinii, дают наиболее яркое свечение; волосы, пораженные Т. schonleinii, имеют тусклую зеленоватую флюоресценцию.
Свечение наблюдается только в полностью пораженных грибом волосах. Его может не быть в свежих очагах поражения. В этих случаях следует эпилировать волосы из краевой, наиболее активной зоны, и свечение можно обнаружить в корневой части волос.
Люминесцентный метод можно использовать как для диагностики и контроля за эффективностью лечения у отдельных больных, так и в эпидемиологических очагах. Компактные передвижные установки удобны для обследования контактных людей в школах, детских садах и т. п.
Люминесцентное обследование необходимо производить в затемненной комнате, очаги поражения должны быть предварительно очищены от корок, остатков мази и т. п. Люминесцентный метод можно использовать для диагностики отрубевидного лишая, особенно при локализации очагов поражения на волосистой части головы. Очаги поражения при этом заболевании имеют красновато-желтое или бурое свечение. Это свечение, однако, не является строго специфичным, так как может наблюдаться при наличии перхоти на волосистой части головы и даже у здоровых людей в области устьев волосяных фолликулов на лице и верхней части туловища. Выявленные с помощью люминесцентного метода пораженные волосы должны обязательно подвергаться микроскопическому исследованию.
ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммунологические методы исследования используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний. Для обнаружения специфических антител в сыворотке пробы проводят следующие серологические реакции: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции с соответствующими антигенами.
Аллергическое состояние организма больного выявляют с помощью аллергических кожных проб. Аллергены наносят на скарифицированную кожу по Пирке или втиранием в кожу по Моро, внутрикожно по Манту, а также уколом в кожу. С помощью этих проб выявляют аллергические реакции как немедленного, так и замедленного типа, что позволяет оценить состояние гуморального и клеточного иммунитета.
Для выявления специфической сенсибилизации лимфоцитов используют реакции дегрануляции базофилов, агломерации и альтерации, тест бластной трансформации, подавления миграции макрофагов и т. п.
Сопоставление результатов серологических и аллергических реакций оказывается полезным как для диагностики, так и для прогноза течения микозов.
Биологический метод. Используется для лабораторной диагностики глубоких и особо опасных микозов. Основан на заражении животных патологическим материалом от больного или культурой исследуемого гриба. Осуществляется в специальных лабораториях.
ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Гистология микозов кожи, обусловленных дерматофитами
Патоморфологические изменения в очагах поражения обусловлены внедрением грибов в роговой слой эпидермиса, волосы и ногти и ответной воспалительной реакцией кожи, которая может быть острой, подострой или хронической. Диагноз можно считать установленным только в том случае, если в гистологических препаратах обнаруживают элементы грибов. Для этого используют различные гистологические окраски, наиболее информативной является периодическая кислотная реакция (PAS), позволяющая выявить полисахариды, имеющиеся в целлюлозе и хитине клеточной стенки большинства дерматофитов (окраска по Шифу и ее модификации). Можно также использовать реакции сульфатирования и импрегнацию гистологических срезов серебром [Хмельницкий О. К., 1973; Lewer W. F. и Schaumburg-Lewerl.,1983].
Грибы в роговом слое эпидермиса, даже при использовании специальных окрасок, выявляются в небольшом количестве в виде нитей мицелия и спор. В редких случаях, когда грибов в очагах поражения много, их можно обнаружить в срезах, окрашенных гемотоксилин-эозином, в виде нежных базофильных структур в роговом слое.
Воспалительные изменения в эпидермисе могут быть различными: от незначительного внутри- и внеклеточного отека шиповатых клеток до выраженного спонгиоза. Спонгиоз обычно развивается при дисгидротических вариантах микозов стоп и кистей, клинически в этих случаях отмечаются пузырьки. Причиной этой реакции обычно является Т. mentagrophytes var. interdigitale. Иногда в эпидермисе отмечается выраженный гиперкератоз, что чаще всего наблюдается при микозе, обусловленном Т. rubrum.
Гистологические изменения в дерме неспецифичны и соответствуют острому, подострому и хроническому воспалению.
При микозе гладкой кожи, вызванном Т. rubrum, грибы иногда выявляются в пушковых волосах и волосяных фолликулах. Вокруг фолликулов развивается воспалительная реакция, которая за счет попадания в дерму грибов может приобретать гранулематозный характер. Центральная часть инфильтрата в этих случаях может подвергаться нагноению и некрозу, а периферическая состоять из лимфоцитов, гистоцитов, эпителиоидных и многоядерных гигантских клеток, внутри которых иногда обнаруживаются споры гриба. Размеры спор здесь достигают 6 мкм в диаметре, в волосе обычно не превышают 2 мкм.
При инфильтративно-нагноительной форме микозов волосистой части головы и области роста бороды и усов элементы грибов обнаруживаются в волосяном фолликуле, внутри и вокруг волоса. В волосе они определяются чуть выше зоны начала кератинизации (примерно на уровне 30 мкм). В дерме отмечают воспалительную реакцию различной интенсивности, наиболее выраженную при kerion Celsii. При острой гнойной реакции в составе инфильтрата отмечают большое количество нейтрофильных лейкоцитов, элементы грибов в этом случае могут полностью исчезать. При хроническом течении процесса инфильтрат может приобретать гранулематозный характер, в нем появляются многоядерные гигантские клетки. Для подтверждения диагноза при отсутствии в инфильтрате грибов можно использовать иммунофлюоресцентные методы окраски. Для этих целей применяют меченную флюоресцином антисыворотку к Т. mentagrophytes, которая позволяет обнаружить антигены гриба в волосе и в перифолликулярном инфильтрате.
Формирование инфильтративно-нагноительной реакции кожи при микозе волосистой части головы (kerion Celsii) и области роста бороды и усов, обусловленных грибами М. саnis, Т. tonsurans и Т. verrucosum, представляет собой проявление иммунологической реакции. Об этом свидетельствуют:
1. Склонность очагов поражения к спонтанному разрешению.
2. Отсутствие элементов гриба при очень выраженной воспалительной реакции со стороны кожи при микозе, вызванном Т. verrucosum (faviforme) и Т. tonsurans.
3. Постоянная положительная реакция в ответ на внутрикожное введение трихофитина при инфильтративно-нагноительных формах микоза, вызванного зоофильными трихофитинами (например, Т. tonsurans), и отрицательная - при поверхностных микозах, обусловленных тем же Т. tonsurans.
При фавусе в роговом слое эпидермиса обнаруживается большое количество нитей мицелия и единичные споры гриба. Скутула представлена экссудатом, паракератотическими клетками эпидермиса, клетками воспалительного инфильтрата, а также нитями мицелия и спорами гриба, которые расположены преимущественно в периферической зоне скутулы. В активной стадии болезни в дерме вокруг дегенеративных волосяных фолликулов отмечается выраженный воспалительный инфильтрат, содержащий многоядерные гигантские и плазматические клетки. В старых очагах поражения волосы и сальные железы отсутствуют, имеются явления фиброза.
Гистология микозов кожи и слизистых оболочек, обусловленных дрожжеподобными грибами
При кандидозе кожи и слизистых оболочек грибы рода Candida обнаруживаются в роговом слое эпидермиса или в поверхностных слоях эпителия слизистой оболочки. Элементов гриба обычно мало, они хорошо окрашиваются PAS-peакцией или по Граму; представлены в виде нитей септированного ветвящегося мицелия, размером 2-4 мкм в диаметре, или овоидными спорами, размером 3 - 5мкм в диаметре. Диагностическое значение имеет обнаружение мицелиальной формы гриба.
При гистологическом исследовании хронического гранулематозного кандидоза кожи и слизистых оболочек элементы гриба также преимущественно обнаруживают в роговом слое эпидермиса или в самых верхних отделах эпителия слизистой оболочки, но иногда в шиповатом слое, внутри волоса и в дерме. Отмечается также выраженный гиперкератоз и папилломатоз; в дерме – густой воспалительный инфильтрат, состоящий из лимфоидных клеток, нейтрофилов, плазматических и многоядерных гигантских клеток. Инфильтрат может распространяться в подкожную жировую клетчатку.
При отрубевидном лишае в роговом слое эпидермиса обнаруживают большое количество элементов гриба в виде нежных базофильных структур, которые хорошо видны даже при окраске препаратов гемотоксилин-эозином. Грибы представлены как нитями, так и спорами.
При фолликулярной форме отрубевидного лишая отмечается скопление роговых масс и клеток воспалительного инфильтрата в расширенных устьях волосяных фолликулов. Вокруг фолликулов также отмечают воспалительный инфильтрат. При PAS-реакции сферические или овальные споры гриба, размером 2-4 мкм в диаметре, обнаруживают внутри устья волосяных фолликулов, а иногда в перифолликулярном инфильтрате. Мицелий никогда не выявляется.
Нарушение пигментации кожи у больных отрубевидным лишаем обусловлено способностью гриба Pityrosporum вырабатывать субстанцию, которая угнетает процесс пигментообразования в эпидермисе. Электронно-микроскопическое изучение биоптатов кожи с гипопигментированных участков показало, что в меланоцитах образуются очень маленькие меланосомы, которые не способны проникать в кератиноциты. В гиперпигментированных участках кожи, наоборот, меланосомы крупные и содержат большое количество меланина.
Основными в этиологической лабораторной диагностике микозов до настоящего времени продолжают оставаться классические методы, включающие микроскопию материала, выделение чистой культуры возбудителя с последующей его идентификацией. Иммунологические методы диагностики имеют вспомогательное значение. Они используются для выявления наиболее значимых возбудителей: патогенных диморфных грибов, а также возбудителей криптококкоза, кандидоза и аспергиллеза. Методы геноиндикации (полимеразная цепная реакция) также имеют ограниченное применение ввиду их недостаточной специфичности, но применяются преимущественно при диагностике глубоких и оппортунистических микозов.
Материалом для исследования при лабораторной диагностике микозов в зависимости от формы заболевания могут быть: кожа и ее придатки (волосы, ногти), отделяемое ран и свищей, мокрота, кровь, ликвор и моча, тканевые биоптаты. Правильностью взятия патологического материала во многом определяется эффективность дальнейшего лабораторного исследования. При кожных поражениях материал отбирается чаще всего методом соскобов или с использованием липкой ленты (преимущественно при поверхностных формах) до лечения из свежих, но полностью развившихся очагов по периферии, где находятся наиболее жизнеспособные возбудители.
При выявлении грибов-дерматофитов чрезвычайно информативным материалом являются волосы, поскольку характер поражения волос позволяет идентифицировать возбудителя. Определению очага поражения в ряде случаев помогает использование лампы Вуда. Пораженные волосы вместе с чешуйками извлекаются эпиляционным пинцетом. При хронической черноточечной трихофитии волосы извлекают из кожи препарировальной иглой.
Ногти отбирают на протяжении всех слоев, срезая острым скальпелем или ножницами. Более эффективен отбор с использованием зубного бура. При кандидозных поражениях материал отбирается с помощью соскоба с ногтевого валика. Отобранный материал доставляется в лабораторию в пакетах из темной бумаги, чтобы избежать высыхания и контаминации посторонней микрофлорой. Материал, содержащий гной, доставляется в стерильных бакпечатках или чашках Петри. Мокрота отбирается в стерильную посуду. Исследование мокроты должно быть проведено не позднее 2 ч после сбора. При удлинении сроков исследования образцы должны храниться в холодильнике при + 4 °С, в противном случае могут возникнуть диагностические ошибки, связанные с появлением псевдомицелиальных форм дрожжевых клеток.
Кровь и спинномозговая жидкость отбираются с соблюдением правил асептики. Посев крови осуществляется в жидкую среду Сабу- ро. Для исключения контаминации образцов крови проводят их повторные исследования. Спинномозговую жидкость центрифугируют, а осадок используют для микроскопирования и посева.
Моча отбирается утром в стерильную посуду, при этом необходимо избегать загрязнения материала микрофлорой кожи промежности. Посев мочи осуществляется с использованием количественных методов посева.
В диагностике микозов используются препараты как из нативного материала, так и окрашенные. При исследовании неокрашенных препаратов плотный материал предварительно просветляют (мацери- руют) 10-30% раствором КОН (можно использовать растворы диметил сульфоксида), а затем микроскопируют по методу «раздавленной капли». Для придания контрастности препараты прокрашивают водным раствором метиленового синего.
Окраску фиксированных мазков осуществляют различными способами: по Граму, метиленовым синим, по Романовскому - Гим- зе. Последний способ позволяет увидеть мелкие дрожжевые клетки и стадии фагоцитоза. Для криптококков используют окраску тушью, окраску с муцикармином по Саутгейту. Меланинсодержащие грибы (темноокрашенные), например Cladophialophora bandana , окрашивают по Массой - Фонтана (окраска меланина, входящего в состав клеточной стенки). Флюоресцирующие сыворотки используются при диагностике возбудителей глубоких микозов, возбудителей дерматофи- тии, грибов рода Candida.
Выделение чистой культуры возбудителя дает возможность установить родовую и видовую принадлежность гриба, изучить его свойства и чувствительность к антимикробным препаратам. Для выделения и идентификации грибов используют плотные и жидкие питательные среды Сабуро, сусло-агар. Эти среды обеспечивают рост большинства патогенных и условно-патогенных грибов. Кроме того среда Сабуро (рис. 8.2) стимулирует процессы пигментообразования у грибов, что имеет значение при идентификации.
Для подавления роста бактерий-контаминантов в среды добавляют антибиотики: левомицетин, стрептомицин, пенициллин, тетрациклин. Для выделения прихотливых патогенных грибов используют среды, обогащенные кровью и сердечно-мозговым экстрактом. Специальные среды используют для культивирования и идентификации грибов: среда Чапека - для формирования конидий при идентификации плесневых грибов, картофельный (картофельно-морковный) агар, рисовый агар - для выявления типов роста и получения хламидоспор при идентификации грибов рода Candida , морковный (овощной) агар - для получения типичных колоний культуры гриба Trichophyton schonleini, среда Кашкина - для выделения пигментообразующих грибов. Используются и дифференциально-диагностические среды, например, для идентификации С. albicans - хромогенные среды или среды, позволяющая определить фосфолипазную активность гриба.
Время инкубации грибов составляет от нескольких суток до 1 месяца и более. При подозрении на патогенные диморфные грибы для выдачи отрицательного ответа культивирование проводится в течение 8 недель.
Посевы проводят на среды, разлитые по пробиркам, флаконам и чашкам Петри. Посевы материала на грибы-дерматофиты осуществляют одновременно на несколько пробирок со средой. Материалы, подозрительные на содержание плесневых грибов (мокрота), засевают в 3 точки и инкубируют при 28 и 37 °С. Для решения вопроса об отсутствии контаминации при заборе материала осуществляют контрольные посевы воздуха на содержание плесневых грибов в помещениях лаборатории и палатах, где находятся больные.
При культивировании грибов в микологической лаборатории соблюдаются меры безопасности, аналогичные таковым в бактериологических лабораториях. Работу с плесневыми грибами и микотоксинами во избежание аллергизации персонал проводит в боксированных помещениях в марлевых повязках или в настольных боксах с вытяжкой. Работа с культурами, относящимися ко II группе патогенности (патогенные диморфные грибы), возможна только в специализированных лабораториях.
Идентификация видов грибов проводится на основании комплекса культуральных, морфологических и других признаков. К первым относятся морфология колонии, ее окраска и размеры при культивировании на специальных средах, строение края и центра, характер поверхности, наличие и характер репродуктивных органов, ко вторым - особенности микроскопического строения мицелия, строение, форма и размеры репродуктивных органов - конидиеносцев, конидий, хламидоспор, артроспор и т.д.
Грибы формируют различные типы колоний на плотных питательных средах. Ученые из института Г. Вентера (США), учитывая способность грибов выделять в среду пигментные вещества, создали в питательной среде «новогоднюю елку» (рис. 8.3).
Рис. 8.3. «Новогодняя елка» из грибов (верхушка: Talaromyces stipitatus ; дерево Aspergillus nidulans; украшения: Penicillium marneffei; пенек: Aspergillus terreus)
Ферментативные и ассимиляционные способности культур имеют большое значение при идентификации дрожжей (дрожжеподобных грибов). В настоящее время для идентификации часто встречающихся грибов - возбудителей заболеваний человека и животных - применяются коммерческие тест-системы: BBL Mycotube, API 20С bio Merieux и др.
